4-Nerolidylcatechol induces autophagy in human glioblastoma cells

ABSTRACT Gliomas account for the majority of primary malignant brain tumors and present invasive behavior into adjacent healthy tissue. While 4-NC had previously shown to induce apoptotic cell death in a melanoma model, for the glioma model described in this paper 4-NC is cytotoxic for the cells with the induction of the autophagic pathway. Trypan blue exclusion assay showed that 4-NC was cytotoxic in a dose-dependent manner for A172 and T98G cell lines. IC10 and IC50 values were at 32 µM and 41 µM for A172 and T98G respectively. Inhibition of cell proliferation was observed by total cell counts and by cell cycle analysis by flow cytometry, with cell cycle arrest of A172 and T98G cell lines respectively in the G1/G0 and S phases of the cell cycle. 4-NC induced up-regulation of autophagic pathways, as shown by immunoblotting for LC3-I/II, Real-Time PCR for ATG-7 and Beclin-1 genes, and by fluorescence microscopy observation of autophagic vacuoles in cells transfected with GFP-LC3 and electron microscopy. Glioma cells concomitantly treated with 4-NC and 3-MA, an inhibitor of the autophagic process, are more sensible to cell death, suggesting that autophagy protects the cells from the action of 4-NC.

Efeito do resveratrol e do 2-Metoxiestradiol em linhagens de melanoma humano em modelos de monocamada e de pele reconstituída / Effects of resveratrol and 2-methoxyestradiol in human melanoma cell lines in monolayer and skin reconstruct models

Os melanomas são o tipo mais mortal de câncer de pele, apesar da baixa incidência, 80% das mortes de câncer de pele são devem-se ao melanoma metastático. Novas abordagens farmacológicas e a busca por novos compostos para a terapêutica do melanoma, em aplicações isolados ou em combinação com outros fármacos é imprescindível. Esta busca ocorre principalmente no campo das terapias de alvos específicos, devido à aquisição de resistência tumoral e recidiva. O resveratrol (RES) é um polifenol com atividade anti-oxidante, e seu efeito anti-tumoral foi mostrado pela indução de morte celular, porém o seu estudo não foi aprofundado pela inviabilidade do uso de altas doses in vitro para observação de efeitos celulares. Outro composto, o 2-methoxiestradiol (2ME) é um metabólito do estrógeno cujo efeitos anti-câncer já foi demonstrado em melanoma, porém sem elucidação das vias de sinalização envolvidas. O efeito em células com resistência adquirida também nunca foram testados. Neste estudo ampliamos o painel de linhagens celulares de melanoma humano, e demonstramos que o 2ME induz morte celular, inibe a proliferação destas células sendo que esta inibição está associada a indução de senescência. Pela primeira vez foi observada a inibição de proliferação pelo 2ME em células com a mutação BRAF V600E resistentes ao vemurafenibe (inibidor de BRAF) e duplo resistentes ao vemurafenibe e trametinibe (inibidor de MEK). A inibição de proliferação foi acompanhada pela modulação de p21Cip1, Ciclina B1, pRb, proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular. A exposição prolongada ao 2ME inibiu a formação de colônias em todas as linhagens de melanoma (não resistentes e resistentes), mas não teve o mesmo efeito em fibroblastos primários, mostrando efeito seletivo. Em modelo tridimensional de esferóides, foi observado que as linhagens resistentes (Sk-Mel-28R) e duplo resistentes (Sk- Mel-28RT) são mais invasivas que a parental (Sk-Mel-28). Neste modelo, o 2ME foi capaz de inibir a invasão e viabilidade destas células. No modelo de pele reconstituída, na ausência de tratamento, observa-se invasão das células de melanoma pela derme, porém este fenômeno é diminuído quando as peles são tratadas com 2ME. Estes resultados demonstram que o 2ME é um efetivo agente anti-melanoma, independente de sua resistência

Melanomas are the deadliest type of skin cancer, and in spite of the low incidence, 80% of the skin cancer associated death cases are due to metastatic melanoma. New pharmacological approaches and the search of new compounds for melanoma therapeutics, for monotherapy or combination therapy, are essential. This search occurs mainly in the targeted therapy field because of the melanoma acquisition of resistance to the current treatments. Resveratrol (RES) is a polyphenol with anti-oxidant activity, and its anti-tumor effect has been shown through the induction of cell death. However, the study of this compound has been discontinued in this work due to the impossibility of using high doses in vitro for the observation of cellular effects. Another compound, 2-methoxyestradiol (2ME) is a metabolite from estrogen, and its anti-cancer effects has already been shown in melanoma, but with no elucidation of the signaling pathways involved. Furthermore, the effects in cells with acquired resistance have never been shown. In this study we used a broader panel of human melanoma cell lines and demonstrated that 2ME induces cell death, inhibits proliferation of these cells, and this inhibition is associated with the induction of cell senescence. The inhibition of proliferation caused by 2ME was observed for the first time in BRAF V600E cells that are resistant to Vemurafenib (BRAF inhibitor) and double resistant to Vemurafenib and Trametinib (MEK inhibitor). The proliferation inhibition was related to the modulation of p21Cip1,Cyclin B1 and pRb, which are proteins involved in cell cycle regulation. Long exposure to 2ME in colony formation assay showed the inhibition of colony in all melanoma cell lines (regardless of resistance and mutational status), but not in primary fibroblasts, showing selective effect. In three-dimensional spheroid model, it was observed that the resistant (Sk-Mel- 28R) and double-resistant (Sk-Mel-28RT) cell lines were more invasive than the parental cell line (Sk-Mel-28). In this model, 2ME was able to inhibit cell invasion and cell viability. In the skin reconstruct model, in the absence of treatment, melanoma cell invasion can be observed in the dermis layer. However, after the treatment with 2ME these cell invasion foci are inhibited. Altogether, these effects demonstrate that 2ME is an effective anti-melanoma agent, regardless of resistance